Изучение распределения и основных фармакокинетических параметров окисленных одностенных углеродных нанотрубок.

Авторы: В.Н. Алдобаев, Л.А. Еременко, А.А. Мазанова, Д.Х. Бикетова, Н.Р. Дядищев, С.П. Рыбалкин, Л.Д. Квачева, Г.А. Бадун, С.П. Червонобродов, В.Е. Мурадян, А.А. Масликов.

Введение

Развитие и внедрение в различные производства нанотехнологий существенно опережает знания в области токсикологии наноматериалов, а также рисков для здоровья человека, связанных с применением нанотехнологий.

В процессе производства наноматериалов, их использования в технологических циклах других производств, при транспортировке, ремонте оборудования, производственных авариях, при утилизации объектов, содержащих наноматериалы, персонал и люди, не связанные с производством, могут подвергаться опасности контакта.

Наночастицы, попадая внутрь организма, оказывают токсическое действие по совершенно иным механизмам, чем крупные частицы микрометрового диапазона или молекулы химических веществ, из которых состоят наноструктуры.

Проведенные многочисленные эксперименты четко указывают на то, что благодаря своим малым размерам, наночастицы могут преодолевать биологические барьеры, попадая внутрь клеток макроорганизмов. Есть данные о проникновении наночастиц через кожные покровы, преодолении барьера желудочно-кишечного тракта, гемато-энцефалического, гемато-ликворного и других биологических барьеров.

Большинство исследований в области нанотоксикологии к настоящему моменту выполнено in vitro на клеточных культурах; на лабораторных животных проведены лишь фрагментарные исследования [5—9].

Комплексная оценка токсичности новых наноматериалов на лабораторных животных является ключевым этапом оценки рисков при использовании нанотехнологий.

Одним из наиболее востребованных видов современных наноматериалов являются наноструктурированные формы углерода, а именно углеродные нанотрубки. Многим исследователям в области фармакологии одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ) представляются одним из удачных решений для создания универсальной транспортной системы доставки лекарственных средств с широкой перспективой использования их в наномедицине. Поэтому задача всесторонней токсикологической оценки ОУНТ приобретает сегодня особую актуальность. Кроме того, важным является оценка токсичности промежуточных продуктов и санитарно-гигиеническое нормирование условий производства ОУНТ.

На первой стадии производства ОУНТ при электродуговом способе синтеза в реакторе образуется большое количество технического продукта («as produced» по терминологии производителя), который в качестве примесей содержит в основном аморфный углерод (сажу), частицы металлов-катализаторов (никель и иттрий) в свободном виде и заключенных в графитовую оболочку, а также собственно графитовые наночастицы. С точки зрения промышленной токсикологии этот продукт наиболее важен для исследования. Он попадает во все последующие производственные циклы для дальнейшей очистки, поэтому является основным загрязнителем воздуха рабочей зоны и потенциальным загрязнителем объектов окружающей среды.

На сегодняшний день по информации от производителей наиболее востребованным продуктом производства ОУНТ является продукт первой стадии очистки — длинные окисленные одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ-СООН). Этот промежуточный продукт уже является максимально чистым и все возможные дальнейшие производственные процедуры («отжиг», модификация, «резка» и проч.) увеличивают себестоимость без принципиального увеличения чистоты. Кроме того, ОУНТ-СООН являются удобной заготовкой для дальнейшей химической модификации по усмотрению заказчика.

Поэтому оценка ADME параметров с учетом рекомендаций по доклиническому изучению новых фармакологических веществ [4] была начата с этого продукта. Результаты экспериментов по изучению общей токсичности технического продукта не являются темой рассмотрения данной статьи, и планируются к отдельной публикации.

Материалы и методы исследований

ОУНТ отечественного производства для исследований были на контрактной основе предоставлены ООО «Карбонлайт».

Были исследованы ОУНТ-СООН, со следующими характеристиками: диаметр ОУНТ-СООН — 0,9—1,5 нм; длина — 0,5—3,0 микрон; степень очистки — 80—85% по углероду (Рис.1), 1—2 % по металлам; в сухом виде ОУНТ-СООН агрегированы в пучки диаметром 20—50 нм; по данным термогравиметрического анализа (ТГА) температура горения ОУНТ-СООН в атмосфере воздуха составляет 600—750°С; на графеновой поверхности и фуллереновых полусферах имеются атомы углерода, несущие гидроксильные и карбоксильные группы, количество «дефектных» атомов < 5% от общего количества структурообразующих атомов углерода; метод синтеза — электродуговой, с использованием никеля и иттрия в качестве катализаторов; методы очистки — обработка кислотами и высокотемпературный отжиг на воздухе.

На рисунке 2 представлены результаты термогравиметрического анализа ОУНТ-СООН. Кривые ТГ и ДТГ характеризуют равномерное окисление образца с началом окисления при ~ 500°С и максимальной скоростью горения при 620°С. Форма кривых свидетельствует об отсутствии в образце аморфного углерода, который сгорает при более низких температурах нагрева. Образец ОУНТ-COOH демонстрирует в данном случае высокую устойчивость к окислению, а также отсутствие значительного числа нанотрубок малого диаметра (0,8-1 нм) и «дефектных» нанотрубок.

На рисунке 3 представлен ИК-спектр ОУНТ-СООН.

В спектре присутствуют характерные линии валентных колебаний С=O карбоксильных групп 1700—1725 см¹ , О-Н спиртовых групп 3600—3650 см¹.

Для изучения распределения, экскреции и оценки основных фармакокинетических параметров на животных тест-системах были отработаны условия включения 3Н — метки в ОУНТ. Радиоактивную метку включали в препараты методом термической активации [1].

Истинная удельная активность полученного таким способом меченого препарата, определяемая при их полном разложении, составила 1,45—1,80 мКи/мг.

Количественное определение меченых препаратов в тканях экспериментальных животных проводили с учетом оценки уровней сцинтилляции минерализатов биологических образцов.

Были выбраны оптимальные условия минерализации: биологический образец полностью растворяли 3М KOH на кипящей водяной бане (в случае цельной крови или образцов ткани с высоким содержанием крови добавляли к щелочному раствору 50% перекиси водорода). Затем аликвоты охлажденных минерализатов переносили в сцинтилляционную жидкость “Optiphase HiSafe” оптимизированную для определения трития. Измерение уровня сцинтилляции проводили на жидкостном β,γ-счетчике «THRIATHLER».

Для последующего количественного определения меченых препаратов 3Н-ОУНТ-СООН в минерализатах тканей экспериментальных животных строили градуировочные характеристики зависимости уровня сцинтилляции от количества 3Н-ОУНТ-СООН в сцинтилляционном флаконе в условиях добавки оптимальных объемов щелочных минерализатов крови, тканей внутренних органов и мочи, взятых у интактных крыс.

При построении градуировочных характеристик и позже при введении животным для получения стабилизированных водных суспензий ³Н-ОУНТ-СООН применялся неионогенный ПАВ — проксанол-268, солюбилизирующий компонент препарата «Перфторан», используемого в качестве кровезаменителя [2].

Суспензии ³Н-ОУНТ-СООН для построения калибровочных зависимостей и введения экспериментальным животным приготовляли в 4% «вес/объем» проксаноле-268 с обработкой ультразвуком с помощью ультразвукового диспергатора Ultrasonic Processor «Cole Parmer» в течение 30 мин при выходной мощности излучателя 600 Вт и внешним охлаждением емкости с суспензиями при 4°С ± 2°С.

Эксперименты по оценке ADME параметров проводили на аутбредных крысах массой до 200 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария, на рационе, соответствующем действующим нормам [3]. Фармакокинетические характеристики ³Н-ОУНТ-СООН изучали при трех различных способах введения, а именно, внутривенном, эндотрахеальном и внутрижелудочном.

Для внутривенного введения аутбредные крысы-самцы были распределены на несколько весовых групп. Всего с учетом разброса весов экспериментальных животных было создано 4 опытных группы, в каждой группе доза ³Н-ОУНТ-СООН составляла 0,35 мг/кг. Объем введения для всех животных во всех группах был одинаков и составлял 0,3 мл. Местом введения традиционно была выбрана латеральная хвостовая вена. После введения препарата через фиксированные промежутки времени (5, 10, 30 мин, 1, 2, 4 часа, 1, 6, 14 и 30 суток) животных умерщвляли путем цервикальной дислокации и вскрывали с помощью стандартных хирургических инструментов с целью отбора проб: крови (из полостей сердца), головного мозга, легких, сердца, печени, почек, мышцы (бедра), селезенки, тимуса и семенников. На каждую временную точку приходилось по шесть экспериментальных крыс, данные от которых усреднялись.

В качестве предварительных были проведены эксперименты для оценки проницаемости барьеров желудочно-кишечного тракта и верхних дыхательных путей для ОУНТ-СООН. Для эндотрахеального введения было взято 12 аутбредных крыс весом 200—250 г. Вводимый объем суспензии ³Н-ОУНТ-СООН (3 мг/мл в 4% «вес/объем» проксаноле-268) составил 0,02 мл. Доза ³Н-ОУНТ-СООН и соотвественно активность, отнесенные на килограмм веса животного, в этом опыте соответствовали таковым в эксперименте по внутривенному введению. Было исследовано несколько реперных временных точек — 2, 5, 24 и 48 часов с момента эндотрахеального введения. На каждую временную точку приходилось по три животных. К набору органов и тканей, описанному выше, были добавлены: трахея, бронхи, бронхиально-альвеолярный лаваж и моча из мочевого пузыря (по возможности), каловые массы из толстого кишечника.

Для внутрижелудочного введения было взято 9 аутбредных крыс весом 200—230 г. Вводимый объем суспензии ³Н-ОУНТ-СООН (0,045 мг/мл в 4% «вес/объем» проксаноле-268) составил 2 мл. Доза ³Н-ОУНТ-СООН и соотвественно активность, отнесенные на килограмм веса животного, в этом опыте соответствовали таковым в эксперименте по внутривенному введению. За 12 часов до введения животные были ограничены в еде и не ограничены в питье. Непосредственно после введения часть животных оставляли ограниченными в еде, часть содержали на нормальном рационе вплоть до момента вскрытия.

Были исследованы три реперные временные точки — 3, 5 и 24 часов с момента внутрижелудочного введения. К стандартному набору органов и тканей, описанному выше, были добавлены: биоптаты толстого и тонкого кишечника, каловые массы из толстого кишечника.

В экспериментах по внутрижелудочному и эндотрахеальному введению препаратов ³Н-ОУНТ-СООН эвтаназию экспериментальных животных перед вскрытием проводили в атмосфере углекислого газа.

Кроме того, была проведена серия экспериментов по сравнительной оценке почечной экскреции ³Н-ОУНТ-СООН. Суспензии ³Н-ОУНТ-СООН вводили крысам внутривенно, внутрижелудочно и эндотрахеально в дозе 0,35 мг/кг, объемы введения составляли 0,3; 5,0 и 0,02 мл соотвественно. В эксперименте использовали самцов аутбредных крыс массой 200— 250 г. Непосредственно после введения животных помещали в метаболические клетки компании «Techniplast» из расчета одно животное на клетку. Экспериментальные группы по каждому виду введения состояли из шести животных. В первые восемь часов после введения мочу собирали по возможности дробно через каждые два часа, далее в течение месяца собирали суточную мочу при внутривенном введении и 10 суток в случае внутрижелудочного и эндотрахеального введений. В последних двух случаях дальнейший суточный сбор мочи не имел значения, поскольку уровни активности суточных порций мочи к 10 суткам с момента введения выходили на фоновые значения.

Для каждой пробы мочи фиксировали объем, часть пробы подвергали щелочной минерализации и, измеряя активность каждого минерализованного образца, определяли диурез активности. Диурез активности в соответствии с градуировочной характеристикой пересчитывали на абсолютное содержание 3Н-ОУНТ-СООН в пробах без учета возможных метаболических процессов.

Данные по содержанию ³Н-ОУНТ-СООН в различных тканях и других биологических материалах лабораторных животных, полученные в различные моменты времени после введения суспензии, обрабатывали специализированной программой для оценки фармакокинетических и токсико-кинетических параметров - WINNONLIN NONLINEAR ESTIMATION PROGRAM Version 5.2 Build 200701231637 Core Version 19 Dec 2006. Программа была приобретена у компании разработчика Pharsight Corporation (США) специально для этих целей.

Результаты и обсуждение

При внутривенном введении из обследованного набора тканей и органов наибольшие концентрации 3Н-ОУНТ-СООН были обнаружены в трех органах: печени, легких и селезенке. Эти органы выступают в качестве активных накопителей ³Н-ОУНТ-СООН в силу особенностей строения их гистогематических барьеров, интенсивности кровоснабжения, основных физиологических функций и демонстрируют сходные максимальные концентрации аналита. Остальные органы показали уровни накопления ³Н-ОУНТ-СООН на порядок и два порядка ниже, чем в печени, легких и селезенке.

Данные по основным параметрам распределения 3Н-ОУНТ-СООН по органам после однократного внутривенного введения крысам представлены в Табл. 1.

Таблица 1

Сравнительные значения коэффициентов пропорциональности в цепочке почва-продукты питания, Бк/кг:кБк/м²

Примечание: C_max — максимальная концентрация вещества (расчетное значение); T_1/2 — время достижения Cmax (расчетное значение); V_ss — квазистационарный объём распределения; V_d — относительный объём распределения; Cl — общий клиренс крови; T_1/2 — период полувыведения; AUC — площадь под фармакокинетической кривой ­­«концентрация (C) — время (t)» в крови при внутривенном введении.

При эндотрахеальном введении во всех временных точках в тканях основных органов обнаруживалась активность, превышающая фоновые значения только в 2— 2,5 раза. Исключения составил образец трахеи через 2 часа после введения, в нем содержание ³Н-ОУНТ-СООН соответствовало таковому в образце ткани легких через 2 часа после внутривенного введения и составляло ≈ 2мг/кг. В последующие моменты времени трахея очищалась, и в ней обнаруживались фоновые значения активности. В точках 2 и 5 часов в моче, взятой из мочевого пузыря, обнаруживались значимые количества активности, а у «48-часовой» крысы была обнаружена высокая активность в каловых массах.

Учитывая все эти данные, можно предположить, что препарат обладает крайне низкой резорбцией при эндотрахеальном введении. Вероятно, относительно крупные частицы (L — 1,5-3,0 мкм) ³Н-ОУНТ- СООН, естественно не растворимые в секрете трахеобронхиальных желез, в течение 5 часов удаляются по механизму мукоцилиарного транспорта (важнейший механизм освобождения дыхательных путей от ингалированных частиц аэрозолей) из верхних дыхательных путей животного. Далее препарат попадает из ротовой полости с водой и пищей в желудочно-кишечный тракт, откуда в свою очередь резорбция тоже очень невысока. Из желудочно-кишечного тракта экскреция ³Н-ОУНТ-СООН происходит естественным путем с каловыми массами.

При внутрижелудочном введении во всех временных точках в тканях основных органов обнаруживалась активность, также превышающая фоновые значения только в 2—2,5 раза. У «24-часовой» крысы была обнаружена высокая активность в каловых массах.

Учитывая все эти данные, можно предположить, что препарат обладает крайне низкой резорбцией и при внутрижелудочном введении. Вероятно, сильная сорбция ОУНТ-СООН на остатках пищи в кишечнике и характеристики проницаемости таких биологических барьеров как эпителий тонкой и толстой кишки организма теплокровных (липидная мембрана с порами малого диаметра 0,3-0,8 нм) не позволяют крупные частицам (L — 1,5-3,0 мкм) ³Н-ОУНТ-СООН проникать в кровоток. Из желудочно-кишечного тракта экскреция ³Н-ОУНТ-СООН происходит естественным путем с каловыми массами.

Данные по основным параметрам почечной экскреции для ³Н-ОУНТ-СООН при различных способах введения представлены в Табл. 2.

Сравнивая основные параметры почечной экскреции 3Н-ОУНТ-СООН для различных способов введения на сопоставимых отрезках времени (10-суток), можно сделать заключение о равенстве этих параметров для в/ж и э/т способов введений. При внутривенном способе введения мы получали несколько большие скорости экскреции и соответственно величины экскреции за период наблюдения при сохранении общей кинетики процесса на том же уровне что и в случае внутрижелудочного и эндотрахеального поступлений 3Н-ОУНТ-СООН. Если исходить из того, что кинетика экскреции определяется химической природой препарата 3Н-ОУНТ-СООН и путями его метаболизма, полученные результаты совпадают с ожидаемыми.

Таблица 2

Основные параметры почечной экскреции определенные на модели самцов аутбредных крыс при однократных в/в, в/ж и э/т введениях за период 10 суток.

Примечание: в/в — внутривенное введение; в/ж — внутрижелудочное введение; э/т — эндотрахеальное введение; Т_1/2 — период полувыведения; V_max — максимальная скорость экскреции; AR_{10 сут} — общее экскретированное количество за 10 суток; D — введенная доза; AR_{10 сут} / D — отношение общего экскретированного количества к введенной дозе.

Выводы

1. Исходя из картины распределения нанотрубок по организму при поступлении ОУНТ-СООН в системный кровоток теплокровных животных, можно предположить, что основными потенциальными органами-мишенями являются печень, селезенка и легкие.
2. При естественных путях поступления ОУНТ-СООН (L — 1,5-3,0 мкм) через желудочно-кишечный тракт и дыхательные пути биологические барьеры этих систем оказываются практически непроницаемыми для ОУНТ-СООН, что свидетельствует в пользу потенциально малой токсичности этого вида нанотрубок для теплокровных животных.
3. Из анализа кинетических параметров можно сделать предварительные выводы о медленных метаболических процессах в организме лабораторных животных, направленных на выведение ОУНТ- СООН. Предпологается что в основе этих процессов лежит окислительное разрушение графеновой поверхности в местах случайных радиальных скоплений дефектов с последующей фрагментацией ОУНТ-СООН.

Литература

1. Алдобаев В.Н., Еременко Л.А., Мазанова А.А. и др. Изучение распределения, экскреции и оценка основных фармакокинетических параметров одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ) в организме мелких лабораторных животных при различных способах введения // Сборник тезисов докладов научно-технологических сессий Международного форума по нанотехнологиям «Rusnanotech’08», Москва, 2008. — т. 2. — С. 314-315.
2. Иваницкий Г.Р., Воробьев С.И. Кровезаменитель “Перфторан” // Вестник РАН., 1997. — Т. 67. — №11. — С. 998-1013.
3. Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения. Приказ Минздрава СССР от 14.10.83 года №1179.
4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. — 2-е изд. перераб. и доп. — М.: Медицина, 2005. — С. 41-54.
5. Grubek-Jaworska Н., Nejman Р., Czuminska К., et all, Preliminary results on the pathogenic effects of intratracheal exposure to one-dimensional nanocarbons, Carbon 44, (2006), 1057-1063.
6. Monteiro-Riviere N.A., Inman A.O., Challenges for assessing carbon nanomaterial toxicity to the skin, Carbon 44, (2006), 1070-1078.
7. Muller J., Huaux F., Lison D. Respiratory toxicity of carbon nanotubes: How worried should we be? Carbon 44, (2006), 1048-1056.
8. Smart S.K., Cassady A.I., Lu G.Q., Martin D.J. The biocompatibility of carbon nanotubes, Carbon 44, (2006), 1034-1047.
9. Wang H., Wang J., Deng X., et all, Biodistribution of carbon single-wall nanotubes in mice, J. Nanoscience and Nanotechnology Vol.4, №8, (2004), 1019-1024.

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- информация

Рабочее совещание пo организации профпатологической помощи в Центрах профпатологии и профильных научно-исследовательских институтах ФМБА России.

В апреле 2011 г. в Санкт-Петербурге на базе ФГУЗ «Клиническая больница №122 им. Л.Г. Соколова ФМБА России» прошло рабочее совещание по организации профпатологической помощи в Центрах профпатологии и профильных научно-исследовательских институтах ФМБА России. В работе совещания приняли участие делегаты из 16 городов, 21 лечебно-профилактического учреждения ФМБА России, Санкт-Петербургской академии последипломного образования и институтов повышения квалификации, представители 9 Центров профпатологии, а также службы профпатологии системы Минздравсоцразвития и Роспотребнадзора.

Сегодня профпатологическая служба ФМБА России — это 9 Центров профпатологии, располагающихся на базах клинических больниц, центров и медико-санитарных частей. Руководством ФМБА России постоянно проводятся мероприятия по оптимизации всех сфер деятельности Центров: состояния юридической базы, кадрового состава, лечебно-диагностического процесса. Создаются и новые центры профпатологии.

По итогам совещания были приняты решения, основные из которых - повышение квалификации врачебного состава Центров профпатологии, расширение спектра современной диагностики и экспертизы, оснащение Центров профпатологии медицинским оборудованием в соответствии с утвержденным стандартом, усиление работы по научно-методическому сопровождению их деятельности. Проводить подобные совещания планируется раз в год.