Изучение биоцидного действия интерполимерного покрытия на основе полигексаметиленгуанидина.

Авторы: О.Н. Доброхотский, Г.А. Зиновьев, И.И. Воинцева, О.Н. Скороходова, Н.В. Негрий, А.Л. Мазанов, Р.В. Боровик.

В основу Руководства по контролю качества питьевой воды, изданного Всемирной организацией здравоохранения, заложены основные критерии, которые состоят в следующем: питьевая вода должна быть безопасна в эпидемическом отношении, безвредна по химическому составу и обладать благоприятными органолептическими свойствами [6].

Вода из природных поверхностных источников все менее пригодна для непосредственного использования, так как может стать фактором передачи возбудителей многих бактериальных и вирусных инфекций. Кроме типичных патогенных бактерий в питьевой воде могут находиться условно-патогенные микроорганизмы, эпидемиологическое значение которых в настоящее время существенно возросло (E.coli, P.aeruginosa, Salmonella spp. и др.).

Наибольшую опасность представляют микробные сообщества бактерий (биопленки): слой поверхностных экзополисахаридов и межклеточный матрикс в составе биопленки защищает бактерии от воздействия дезинфектантов [5]. Биопленки оккупируют внутренние поверхности водопроводных труб, часто располагаются в труднодоступных местах. Обработка дезинфицирующими средствами нарушает только верхний слой биопленки, поэтому жизнеспособные бактерии, находящиеся в глубине биопленки, выделяются в воду, что приводит к бактериальному загрязнению водопроводной воды [8].

Среди дезинфектантов для обеззараживания питьевой воды чаще всего используют хлор, который обладает серьезными недостатками: токсичностью, коррозионной активностью. Быстро улетучиваясь из воды, хлор оставляет в ней свыше 300 токсичных хлорорганических соединений, обладающих кумулятивным и канцерогенным действием. Хлор в водопроводной воде не должен превышать предельно допустимую концентрацию, а при таких концентрациях уничтожаются далеко не все находящиеся в воде микроорганизмы: некоторые споры бактерий, а также цисты простейших и яйца гельминтов устойчивы к реагенту. Поэтому хлорирование питьевой воды не всегда гарантирует предупреждение водных вспышек инфекционных заболеваний, особенно в период паводка или массового развития сине-зеленых водорослей («цветение» воды).

Важнейшими задачами в области дезинфектологии является разработка принципиально новых дезинфицирующих средств для обеззараживания воды, обладающих широким спектром и пролонгированностью биоцидного действия, низкой токсичностью и безопасностью для окружающей среды. К такого рода дезинфектантам относятся полимерные биоцидные препараты — полигуанидины, главным представителем которых является полигексаметиленгуанидин гидрохлорид (ПГМГхл):

ПГМГхл — твердое, термически стабильное вещество без цвета и запаха, легко растворяется в воде, обладает антимикробной, антивирусной, спороцидной, фунгицидной, альгицидной активностью, не вызывают коррозию оборудования; относится к III классу умерено опасных соединений при попадании в желудок и к IV классу малоопасных соединений при попадании на кожу (по ГОСТ 12.1.007-76), биоразлагаем. Водные растворы ПГМГхл широко используются в дезинфекционной практике, а также в качестве биоцидной добавки в различные композиционные материалы [3].

Установлено, что при концентрации 0,5мг/л в воде ПГМГхл со 100%-ной эффективностью инактивирует бактерии E.coli, добавленные в воду в концентрации 105 КОЕ/мл [7]. ПГМГхл разрешен для обеззараживания питьевой воды: в концентрации 1 мг/л он полностью обеззараживает воду и безопасен для использования (Гигиенический сертификат № lВ-ll/897 от 29.07.1994 г). Однако для предотвращения биообрастания оборудования требуются концентрации ПГМГхл от 3,0 до 75 мг/л, а в случае роста микрофлоры полное ее уничтожение достигается при добавлении реагента в концентрации 2x104 мг/л [3].

Поэтому, в некоторых случаях удобнее использовать ПГМГ в виде водостойкого биоцидного покрытия, нанесенного на поверхность оборудования, поскольку использование растворимого полимера требует постоянного контроля и Поддержания его концентрации на необходимом уровне.

С целью получения водостойкого биоцидного покрытия мы использовали способность гуанидиновых группировок ПГМГхл вступать в химическое взаимодействие с легко подвижными атомами хлора, содержащимися в пленкообразующем полимере — ХСПЭ [6]. Химическую реакцию между двумя полимерами проводили в сольвенте при комнатной температуре; образующийся раствор интерполимера представляет собой биоцидный лак для защиты поверхности. Способ получения биоцидного лака и подготовка поверхностей для его нанесения описаны нами в патенте [2]. Такой лак под названием «Интерцид» или «Септопаг» рекомендован для пролонгированной дезинфекции помещений с большим скоплением и длительным пребыванием людей [1,9].

В данной работе изучена возможность использования интерполимерного лака для обеззараживания или консервации питьевой воды, для борьбы с биообрастанием поверхностей и предотвращением образования биопленок.

Состав биоцидного лака изменяли таким образом, чтобы интерполимерное покрытие содержало от 9,5 до 30% химически связанного ПГМГхл. Для проведения испытаний биоцидный лак наносили на стальные загрунтованные пластины площадью 25 см² и отверждали 2 часа при 70°С. Полученные покрытия обладают хорошей адгезией к поверхности; являются каучуками с высоким модулем эластичности (как исходный ХСПЭ); относительная твердость 0,12—0,20 у.е., прочность при ударе — 50 см, эластичность при изгибе — 1 мм; покрытия выдерживают нагревание до 170°С.

Из полученных покрытий, водной экстракцией удаляли свободный ПГМГхл до тех пор, пока концентрация последнего в воде над покрытием стабилизировалась на уровне 0,1 — 0,2 мг/л. Концентрацию ПГМГхл в воде определяли по методике Ефимова K.M. с соавторами [4]. Затем образцы покрытий помещали в воду и определяли их водостойкость, а также эффективность и безопасность использования в контакте с питьевой водой.

Водостойкость покрытий, содержащих от 9,5 до 30% связанного ПГМГхл, изучали по ГОСТ 9.403-80 (метод 1) и установили, что водостойкостью обладают покрытия, содержащие от 9,5 до 19% связанного ПГМГхл; покрытия с более высоким содержанием ПГМГхл разрушаются в воде.

Для изучения биоцидной эффективности покрытий, содержащих от 9,5 до 19% связанного ПГМГхл, в качестве тест-культуры использовали E.coli, штамм 25922.

Пластины с интерполимерными покрытиями, а также загрунтованную пластину без покрытия (контроль) помещали в отдельные емкости с дехлорированной водопроводной водой; воду над пластинами контаминировали E.coli в концентрации 50-100 КОЕ/мл. Емкости хранили при комнатной температуре, периодически перемешивая воду и отбирая пробы воды для анализа, а также делали смывы с поверхности пластин. В пробах воды определяли концентрацию жизнеспособных клеток Е. coli и концентрацию свободного ПГМГхл.

Исследования показали, что интерполимерные покрытия, подобно свободному ПГМГхл, полностью инактивируют E.coli: В воде над пластинами с интерполимерными покрытиями концентрация бактерий E.coli быстро уменьшается, тогда как в контрольной воде наблюдается интенсивное размножение бактерий (Рис.1). Эффективность обеззараживания воды над всеми интерполимерными покрытиями составляет 100% (Рис. 2). Этот эффект достигается тем быстрее, чем больше содержание связанного ПГМГхл в покрытии: при содержании 15 или 19% связанного ПГМГхл для полной инактивации E.coli требуются 1 сутки, а при содержании 9,5—13,0% связанного ПГМГ — 2 — 3 суток. На поверхности интерполимерных покрытий бактерии E.coli не были обнаружены, тогда как на поверхности контрольной пластины концентрация бактерий росла на протяжении всего эксперимента (Рис. 1).

Для дальнейших микробиологических и токсикологических исследований было выбрано интерполимерное покрытие оптимального состава, содержащее 19% связанного ПГМГхл и 81% ХСПЭ, которое сочетает наилучшие физикомеханические характеристики, водостойкость и эффективность в отношении E.coli. В результате исследований было установлено, что эффективность такого покрытия в отношении E.coli сохраняется при «водной нагрузке» на покрытие от 20 до 120 мл/см² в интервале температур от 5 до 40°С.

Для изучения спектра биоцидного действия интерполимерного покрытия нами были выбраны следующие тест-микроорганизмы: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cepaciae, Salmonella enteritidis, Bacillus globigii.

Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) — условно патогенная, грамотрицательная бактерия; обнаруживается при абсцессах и гнойных ранах, особенно поражает людей с ослабленным иммунитетом. Длительная выживаемость и размножение этого микроорганизма в окружающей среде и высокая устойчивость к антибиотикам и хлорсодержащим дезинфектантам способствуют ее присутствию в воде бассейнов, баках-накопителях, бальнеосистемах и т.п.

Pseudomonas cepaciae (Burkholderia cepaciae) — условно патогенная бактерия. Вызывает пневмонию, инфекцию мочевых путей, менингит, перитонит, ожоговую и послеоперационную инфекцию, сепсис; с трудом поддается лечению, так как возбудитель устойчив к антибиотикам.

Salmonella enteritidis — грамотрицательная бактерия, вызывает тяжелое поражение желудочно-кишечного тракта (сальмонеллез). Заражение Salmonella enteritidis происходит, в основном, через пищевые продукты, а также через загрязненную воду при ее питье и купании. В водопроводной воде и в открытых водоемах Salmonella enteritidis сохраняются несколько месяцев, устойчива к неблагоприятным условиям окружающей среды, например, к низким температурам, а также к хлорсодержащим дезсредствам.

Bacillus globigii — грамотрицательная бактерия, в цикл развития которой входит спорообразование. Споры Bacillus globigii устойчивы к экстремальным температурам, высушиванию, ионизирующим излучениям, химическим агентам.

Установлено, что в воде над пластинами с интерполимерным покрытием клетки тест-микрорганизмов инактивируются со 100%-ной эффективностью через 1 сутки после начала эксперимента; на поверхности пластин с покрытием бактерии не были обнаружены. В отличие от этого в контрольном опыте в воде и на поверхности пластин концентрация тест-микроорганизмов быстро увеличивается, как показано на рисунке 3 на примере контрольного опыта с Pseudomonas aeruginosa.

При контаминации воды бактериями и спорами Bacillus globigii наблюдение продолжали в течение 300 суток при температуре 20° и 40°С. В воде над интерполимерным покрытием бактерии Bacillus globigii инактивировались через 1 сутки. Концентрация спор Bacillus globigii постепенно уменьшалась; при увеличении экспозиции более 40 суток споры Bacillus globigii в воде не обнаруживались. В контрольном оразце воды концентрация клеток росла, концентрация спор сохранялась на исходном уровне в течение 200 суток, а затем начала расти на поверхности контрольной пластины. Таким образом интерполимерное покрытие обладает сильным бактерицидным и слабым спороцидным действием.

Токсические свойства воды, хранящейся над интерполимерным покрытием оптимального состава, изучали с помощью химического анализа и методом биотестирования на дафниях.

Химический анализ проб воды из емкостей с экспериментальными пластинами показал, что концентрация свободного ПГМГхл в воде на протяжении всех экспериментов составляла 0.1—0.3 мг/л, то есть не превышала предельно допустимую концентрацию для питьевой воды (1,0 мг/л).

Биотестирование воды, выполненное на дафниях (Daphnia magna Straus) в соответствии с методическим руководством РД 118-02.90, показало, что вода, контактирующая с биоцидным покрытием в течение 57 суток, не оказывает токсического действия на дафнии.

Известно, что при хранении водопроводной воды хлор быстро улетучивается и происходит вторичное микробное обсеменение воды за счет попадающих из воздуха и быстро размножающихся микроорганизмов.

В опытах по изучению консервации водопроводной воды пластину с интерполимерным покрытием, а также контрольную пластину помещали в дехлорированную водопроводную воду.

На рисунке 4 показано, что в воде над контрольной пластиной общее микробное число (ОМЧ) быстро увеличивается и через 5 суток во много раз превышает допустимое для питьевой воды значение. Одновременно происходит увеличение ОМЧ и в смывах с поверхности контрольной пластины.

В отличие от этого, в емкости с интерполимерным покрытием микроорганизмы не были обнаружены ни в воде, ни в смывах с поверхности пластины на протяжении всего срока наблюдения 405 суток.

Известно, что адгезия микроорганизмов на поверхности является первым шагом к ее биообрастанию. Адгезия микроорганизмов быстрее происходит в застойной воде, а также на пористых поверхностях.

На рисунке 5 представлены результаты демонстрационного эксперимента после 12 месяцев экспозиции. В открытые сосуды с дехлорированной водопроводной водой были помещены при комнатной температуре два бетонных блока: обработанный интерполимерным покрытием оптимального состава (19% ПГМГхл) и необработанный блок. Наши исследования показали, что интерполимерное покрытие оптимального состава препятствует адгезии микроорганизмов на пористых поверхностях (бетон) в застойной воде при температуре +20±1°С в течение 12 месяцев наблюдения.

Выводы
Биоцидное покрытие ПГМГхл/ХСПЭ, содержащее 19% связанного ПГМГхл, в течение суток полностью обеззараживает воду, контаминированную бактериями Е. coli, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cepaciae, Bacillus globigii.

Биоцидное покрытие указанного состава, нанесенное на поверхность оборудования, контактирующего с водой, предохраняет питьевую воду от вторичного микробного обсеменения и может быть использовано для& консервации питьевой воды, а также для защиты оборудования от биообрастания и биокоррозии (срок наблюдения 405 суток). Биоцидное покрытие эффективно при водной нагрузке от 20 до 120 мл/см² при температуре от +5 до +40°С (изученные пределы).

Биоцидное покрытие безопасно для использования в контакте с питьевой водой, так как выделяет в воду свободный ПГМГхл не выше предельно допустимой концентрации.

Литература

1. Воинцева И.И., Скороходова О.Н., Казеннов И.В., Валецкий П.М. // Лак для биоцидных покрытий // ЛКМ , 1999. №12. С.3-6.
2. Воинцева И.И., Скороходова О.Н., Казакова О.М., Казеннов И.В., Доброхотский О.Н., Борзенкова Т.Х., Боровик Р.В. // Способ пролонгированной дезинфекции помещений, оборудования, консервации и обеззараживания воды // Пат. 2329286 РФ. 2008.
3. Воинцева И.И., Гембицкий П.А. // Полигуанидины — дезинфекционные средства и полифункциональные добавки в композиционные материалы // М.: Издательство «ЛКМ-пресс». 2009 г. 303 с.
4. Ефимов К.М, Данилина Н.И., Овчаренко Е.О., Дергачева Т.В. // Сп. количественного определения концентрации ПГМГхл в воде // Пат 2252413 РФ. 2005.
5. Заславская Н.В., Артеменко Н.К., Чижевская М.М., Тец. В.В. // Особенности выживаемости бактерий в микробных сообществах // Клин. микробиол. антимикроб. Химиотер. - 2000. - Т.2. - С.2-19.
6. Руководство по контролю качества питьевой воды. Т. 1-3. Гигиенические критерии и другая релевантная информация. - ВОЗ. - Женева, 1994. - 255 с.
7. Скороходова, Казеннов И.В., Казакова О.М., Воинцева И.И., Доброхотский О.H., Негрий Н.В. // Интерполимерное лакокрасочное покрытие для консервации и обеззараживания питьевой воды // Лакокрасочная промышленность. 2009. №8. С.20-23.
8. Талаева Ю.Г., Артемова Т.З. // Современные методы оценки степени потенциальной эпидемической опасности питьевого водопользования // Гигиена и санитария, 1988, №8, С.8-11.
9. Федорова Л.С., Цвирова И.М., Белова A.C., Соколова Н.Ф., Воинцева И.И. // Антимикробный лак Интерцид — новая перспективная форма дезинфицирующих средств // Гигиена и санитария. 2000. №5. С.17-19.